1930年5月，写《反对本本主义》，提出“没有调查，没有发言权”的著名论断。同年8月，红军第一方面军成立，任总政治委员。1931年，中华苏维埃共和国临时政府在江西瑞金成立，被选为主席。1933年，被补选为中共中央政治局委员。从1930年底起，同朱德领导红一方面军战胜了国民党军队的多次“围剿”。以王明为代表的“左”倾路线领导集团进入中央革命根据地以后，将毛泽东排斥于党和红军的领导之外，他们执行不同的战略和政策，导致第五次反“围剿”战争失败。1934年10月，参加红一方面军长征。

长征途中，1935年1月中共中央政治局在贵州召开扩大会议（即遵义会议），确立了以毛泽东为代表的新的中央领导。10月，中共中央和红一方面军到达陕北，结束长征。12月，作《论反对日本帝国主义的策略》的报告，阐明了抗日民族统一战线政策。1936年10月，红四方面军和红二方面军经过长征到达甘肃境内，先后同红一方面军会师。同年12月，同周恩来等促使西安事变和平解决，这成为由内战到第二次国共合作、共同抗日的时局转换的枢纽。1936年12月，写《中国革命战争的战略问题》。1937年夏，写《实践论》和《矛盾论》。

抗日战争开始后，以他为首的中共中央坚持统一战线中的独立自主原则，努力发动群众，开展敌后游击战争，建立了许多大块的抗日根据地。这些抗日根据地大部分是在华北山区，但也有的是在河北平原和苏北平原。1938年10月，在中共扩大的六届六中全会上提出“马克思主义中国化”的指导原则。在抗日战争时 期，他发表《论持久战》、《〈共产党人〉发刊词》、《新民主主义论》等重要著作。1942年，领导全党开展整风运动，纠正主观主义和宗派主义，使全党进一步掌握了马克思列宁主义的普遍真理和中国革命的具体实践相结合的基本方向，为夺取抗日战争和全国革命的胜利奠定了思想基础。1943年，领导根据地军民开 展生产运动，渡过了严重的经济困难。同年3月，被选为中共中央政治局主席。