韩春雨实验震惊世界3个月后 多国学者质疑其无法重复

韩春雨

河北科技大学副教授韩春雨震惊全球学术界的新基因编辑技术NgAgo-gDNA，正遭遇越来越多的质疑。从5月2日他的论文发布在《自然-生物技术》网络版之后，到现在为止，全球仍没有一家实验室对外宣布，能够完全成功重复韩春雨的实验。现在已有多国科学家要求《自然-生物技术》介入调查，并公开韩春雨实验中的所有原始数据和实验条件。

北京时间7月29日，一度支持韩春雨的澳大利亚国立大学的基因学家Gaetan Burgio，反戈一击。他在Twitter上发布长文《我的NgAgo经历》，否认了自己7月15日之前部分重复实验时得出的结论，表示并无严格意义上的证据显示韩春雨的NgAgo-gDNA技术有基因编辑的迹象，并且要求韩春雨公开所有原始数据和实验条件。

韩春雨的NgAgo-gDNA技术，挑战的是最为流行的基因编辑技术CRISPR-CAS9，论文刚一发表，就引发了轰动。基因编辑技术是指能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。目前CRISPR-CAS9是最为普遍的基因编辑技术，被称为“基因魔剪”。 5月2日，韩春雨课题组的论文《DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute》在《Nature Biotechnology》在线发表。绕开时兴的CRISPR-CAS9技术，课题组利用格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的Argonaute核酸内切酶，以DNA为介导进行基因组编辑，简称NgAgo-gDNA。

质疑韩春雨的Gaetan Burgio在7月29日发布的长文中介绍了重复实验的具体过程操作和结论，附带了7张实验结果图。

受精卵原核注射NgAgo之后，基于囊胚的PCR结果。

对NgAgo注射过的受精卵PCR产物的T7核酸内切酶检测。

当用高浓度5'磷酸化的ssDNA(25纳克/微升)和NgAgo原核注射小鼠受精卵之后基于囊胚的PCR和电泳凝胶。

对小鼠囊胚进行NgAgo、5’磷酸化ssDNA原核共注射之后获得囊胚，进行DNA提取、PCR扩增和测序之后的一个典型测序结果。

微注射NgAgo的小鼠受精卵凝胶电泳。

代表性的所有电泳胶的序列的Clustal比对。Ank-1作为参考序列。

一个代表性测序色谱图(使用反向引物测序)。

他表示：在多番尝试、试验3个不同的细胞后，没有发现严格意义上证明NgAgo发生基因编辑的证据；在他看来，NgAgo酶需要加热到50摄氏度才能有效，对37摄氏度下NgAgo内切酶的活性表示质疑。

在长文中，Gaetan Burgio表示，“《自然生物技术》期刊应该要求韩春雨公开所有的原始数据和实验条件”，并认为：“NgAgo的未来并不明朗。”

Gaetan Burgio选择了小鼠受精卵进行重复实验。因为他长期研究小鼠细胞，较为熟悉，并在两年半前，用小鼠细胞，完成了他的首次CRISPR-Cas9基因编辑。由于韩春雨的论文中使用的是人体细胞，严格意义上来说，Gaetan Burgio和韩春雨所做的不是同一个实验。但由于小鼠和人体结构相似，一般认为人体细胞能完成的实验也能在小鼠细胞上进行。

在Gaetan Burgio发文后不久，来自西班牙高等科学委员会（CSIC）下设的国立生物技术中心（Centro Nacional de Biotecnologia）的科学家Lluis Montoliu转发了该文，并在Twitter上写道：“CRISPR万岁！！！CRISPR-Cas9系统会用上数百亿万年而不衰。难以击垮。”

twitter截图

据公开资料显示，2015年，Lluis Montoliu从非营利组织“国际转基因技术协会”（The International Society for Transgenic Technologies）卸任主席之位。他的Twitter简介显示，Lluis Montoliu的研究方向是哺乳动物的基因组，以及基于转基因动物研究人类的罕见疾病。

Lluis Montoliu在Twitter上透露，在NgAgo之前，他们曾用大约2年时间，试图测试Ago家族中来自Thermus thermophiles嗜热栖热菌的酶TtAgo，但同样失败。

随后，7月30日，Lluis Montoliu更新博文称，他已经停止了所有关于NgAgo的项目，同时“建议所有想做这件事人不要再浪费资源”。

7月30日傍晚，方舟子在Twitter上贴出四张邮件截图，并附文称“国际转基因技术协会原主席Montoliu今天向协会会员发信，建议停止验证河北科大韩春雨实验，不要再浪费时间、金钱和人员。针对该技术调查表明，140个回复中，只有一个（中国神经所仇子龙？）回答有效，73 个无效，63 个在验证。” 

图片显示，发件方为代表Lluis Montoliu的“国际转基因技术协会”，邮件名为“对Ago的巨大失望：CRISPR万岁！”，发送时间为当地时间7月29日上午9点49分。邮件用加粗字体写道：“（目前最重要的信息是）NgAgo在哺乳动物细胞的基因编辑中不起作用”、“我建议所有人放弃涉及NgAgo的项目”。

方舟子所贴的邮件截图。

但Lluis Montoliu及其所处的“国际转基因技术协会”的言论，引发了部分国内科学家的不满，其中包括中国科学院上海神经科学研究所研究员仇子龙。7月30日晚上，他在实名认证的微博上质疑“国际转基因技术协会”和Lluis Montoliu在领域内的专业性。

仇子龙发文质疑“国际转基因技术协会”和Lluis Montoliu在领域内的专业性。

此前，仇子龙被传出重复实验成功。7月20日，科学网有博文称仇子龙成功重复韩春雨的实验。但仇子龙本人在7月21日作出回应，表示实验室仍在重复，优化各种条件，目前的实验结果距离韩春雨论文中的结果“相差甚远”，并呼吁韩春雨提供“可重复NBT发表文章的NgAgo，或者优化的Ngago2.0，smart版本等等”。

对NgAgo的质疑声自6月下旬开始就陆陆续续，韩春雨本人在百度贴吧上做出过一些回应。

6月28日，他在对网友的回复中表示，新系统刚出来都会“不好使”，他也认同目前NgAgo系统不够稳定，等2.0版本出来会找专门机构免费发放。

面对质疑，他说，“我敢把质粒提交到addgen上，在协和讲座发放质粒，对自己实验的重复性还是很有胆气的。”韩春雨所说的“addgen”其实是Addgene，一家全球科学家质粒共享的非盈利组织。澎湃新闻（www.thepaper.cn）在Addgene官网上的确看到了韩春雨上传的质粒信息。这些质粒可供全球科学家直接用于重复韩春雨的实验。

7月2日，在贴有方舟子质疑原文的帖子中，韩春雨进行了较为详细的回应，强调NgAgo系统对污染特别敏感，实验时不要有寄生菌和支原体的污染，并对实验环节做出技术性的建议。

但7月2日之后，韩春雨不再有新的回复。7月4日，澎湃新闻（www.thepaper.cn）联系上韩春雨，他以“学校告诉我不要做任何回应”回绝。

有基因学家对澎湃新闻（www.thepaper.cn）表示，如果最终《自然-生物技术》杂志在介入调查后也认为韩春雨的实验是无效的，那么他在5月2日发表的论文将会被《自然-生物技术》删除。