“四一二”事变的发生，和南京国民政府的建立，使在国民革命军占领下的广东、福建、广西、安徽、浙江、江苏，以及公开归附国民党的西南诸省，先后都站到了蒋介石南京国民党的一边，江西朱培德则夹在宁汉中间，两边摇摆。共产党及其影响下的左翼国民党人，实际上有效控制的区域，只剩下了湖北和湖南两省区。两省原本就因工农运动造成经济危机，外交关系紧张，如今航运及陆路均遭封锁，财政更加困难，统战关系，乃至军队和工农运动之间的关系，也愈发紧张起来。湖北夏斗寅部和湖南长沙许克祥部相继发动的武装叛乱，更进一步使武汉政府失去了对湖北部分地区，特别是湖南大部分地区控制，从而更加突显了武汉国民党地位的岌岌可危。再加上北京政府这时突然袭击了苏联大使馆，不仅捕杀了包括李大钊在内的一批共产党员和国民党员，而且查抄和很快公布了大批暴露出苏联大力援助国民党和冯玉祥国民军的秘密文件。此举对国民党人和冯玉祥都造成了很大的政治压力。武汉政府甚至解除了鲍罗廷的顾问职务。

面对如此严重的局面，在武汉的鲍罗廷和中共中央主要领导人，均不得不力谋妥协，以求缓和危险局势。然而，斯大林等却因为党内斗争的需要，为否认托洛茨基等关于其中国政策是严重阶级妥协路线的指责，坚持要求中共采取更加激烈的彻底的革命方针。其随后发出的著名的“五月指示”，固然在形式上也肯定“必须同过火行为作斗争”，“不要触及军官和士兵的土地”，要对手工业者、商人和小地主做出让步，但是，它同时强硬要求:（1）坚决主张从下面实际占领土地，对此必须千方百计地加以促进。（2）从下层吸收新的工农领导人加入国民党中央，改变国民党目前的构成。（3）动员两万共产党员和两湖地区五万革命工农，组建自己的军队。（4）成立以著名国民党人和非共产党人为首的革命军事法庭，惩办反动军官。[转见《联共（布）中央政治局会议第107号（特字第85号）记录》，1927年6月2日，《联共（布）、共产国际与中国国民革命运动（1926－1927）》（下），第298－299页。]

莫斯科“五月指示”中的要求，或者因为无法向国民党中央提出，或者因为在如此形势下短时期不可能实行，因而在实际上被中共中央束之高阁。但是，来自莫斯科的共产国际代表团团长罗易，却不甘于此，私下里擅自把莫斯科的来电拿去给武汉国民党领袖汪精卫看，希望能够取得汪精卫的谅解，然后渐次推行。作为一种讨价还价，汪精卫提出了1500万元的贷款要求。而莫斯科研究再三，一时也只能同意提供200万卢布的援助。[《斯大林给莫洛托夫的信》，1927年6月24日；《联共（布）中央政治局会议第113号（特字第91号）记录》，1927年6月27日，《联共（布）、共产国际与中国国民革命运动》（下），第352，364页。]

1927年6月22日，武汉国民党人唯一还可以寄予期望的冯玉祥，公开转向了蒋介石南京国民党人一边，要求武汉国民党遣送鲍罗廷回国，并与共产党实行分离的政策。紧接着，湖南籍将领唐生智、何健等公开站到同情许克祥等人的一边，指责工农运动，并对武汉国民党中央继续容纳共产党人表示不满。7月8日，共产国际执委会在发现形势已不可逆转之后，明令共产党员不能再留在国民政府里面，必须退出政府以示抗议，并准备在排除国民党中央的情况下，自行召集国民党新一届代表大会，以根本夺取对国民党的领导权。时至于此，汪精卫不得不把莫斯科的“五月指示”在党内高层公开出来。其结果可想而知，7月15日，武汉国民党中央最终确定了分共的方针。国共两党党内合作的历史，就此画上了句号。