就在康泽与周恩来会谈的第二天，日军突然发动对上海的大规模进攻。上海军民奋起抵抗，“八一三”淞沪抗战爆发，战火逐步向国民政府所在地南京蔓延。蒋介石措手不及，心中的那点侥幸，彻底破灭，下决心与日本决战。周恩来紧紧把握时机，立即向中共中央请示，在将要进行的谈判中，我们应努力达到：（一）努力抗战，以巩固蒋介石的抗战决心；（二）红军立即改编，争取开动；（三）力争发表《中共中央为公布国共合作宣言》；（四）催促发表正副总指挥。

大敌当前，蒋介石不得不同意中共中央的条件，国共谈判中久拖不决的问题，终于得到落实。18日，蒋介石同意红军改编为国民革命军第八路军，任命朱德、彭德怀为正副总指挥，并于22日正式发表文告。红军改编后的指挥机关和人事任命问题，总算得以解决。9月22日，国民党中央通讯社正式播发《中共中央为公布国共合作宣言》。

根据中共中央书记处的指示，周恩来多次与国民党谈判，强调八路军可以充任战略的游击支队，在总的战略方针下，进行独立自主的游击战争。蒋介石、何应钦同意八路军充任战略游击支队，执行侧面战，协助友军，扰乱与钳制日军大部并消灭一部分的作战任务。八路军的战略任务确定后，周恩来和叶剑英立即致电毛泽东等，部队仍以迅速开拔为有利，提议：“至少应以一个旅为先遣部队，先行东进。”毛泽东当日复电彭德怀、任弼时：“同意恩来提议”。红一军团为先遣部队，即日出动。自8月下旬起，八路军3个师的主力陆续由韩城等处东渡黄河，经同蒲铁路开赴抗日前线。

红军主力的改编刚一落实，周恩来便考虑与蒋介石讨论南方红军游击队的改编和中共合法机构的问题。何应钦代表蒋介石同周恩来具体商谈，他同意中共派人到南方各游击区，传达中共中央指示，并协助红军游击队改编为国民革命军新编第四军。通过这次与蒋介石等的谈判，国民党允许在南京、上海等地设立中共代表团和八路军办事处。后来，又在武汉、长沙、兰州等地设立中共代表团办事处、八路军办事处、新四军通讯处等。

谈判中，周恩来强烈要求国民党释放被关押的共产党员。8月18日，他和叶剑英到“首都反省院”，看望被捕的中共党员，经过反复交涉，当天，夏之栩、熊天荆、王根英获释。随后，陶铸、钱瑛、刘宁一、帅孟奇、张琴秋等也都获释。

还是在庐山谈判时，周恩来便提出中共在南京公开出版发行《新华日报》。当再次磋商此事时，很快便收到国民党中央宣传部长邵力子的批文。周恩来十分高兴，立即和朱德前往拜望国民党元老、监察院院长于右任，请他为《新华日报》题写报名，于右任欣然应允。

南京谈判历时十余天，一些根本问题都得到解决，第二次国共合作的局面正式形成。8月21日，周恩来要参加将在洛川召开的中央政治局扩大会议，离开南京前往西安，谈判中的未竟事宜，交由叶剑英等继续谈判和交涉。